مدلسازی آنالوگ های هایپر گلیکوزیله بتا اینترفرون انسانی با روش مهندسی گلیکوزیلاسیون و بررسی بیان در بیورآکتور

اینترفرون بتا نوترکیب انسانی به عنوان خط اول درمان بیماری مالتیپل اسکلروزیس (ms ) و همچنین درمان انواعی از سرطان ها و عفونت های ویروسی کاربرد دارد. با این وجود ایجاد تجمع پروتئینی که یک مشکل عمده در طی فرایند تولید، نگهداری و کاربرد داروهای زیستی می باشد، استفاده کلینیکی از اینترفرون بتا انسانی را با محدودیت هایی مواجه نموده است. مشخص گردیده که ساختارهای قندی متصل به گلیکوپروتئین ها در افزایش حلالیت مولکول ها و در نتیجه کاهش میزان تجمع پروتئینی موثر می باشند. در این پژوهش استراتژی مهندسی گلیکوزیلاسیون از طریق ایجاد موتیف حفاظت شده n-گلیکوزیلاسیون (asn-x-thr/ser) در طول توالی اسید آمینه، جهت طراحی ناهم ساخت های هایپرگلیکوزیله اینترفرون بتا انسانی و با هدف کاهش میزان تجمع پروتئینی به کار گرفته شده است. بدین منظور از یک متدولوژی طراحی هدفمند با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیکی استفاده شد تا تغییرات عملکردی و ساختاری ناشی از تغییر توالی اسید آمینه پیش بینی گردد. بر این اساس ناهم ساخت های کاندید بر پایه مطالعه مقالات و بررسی ساختار کریستالوگرافی اینترفرون بتا انتخاب شدند. سپس ساختار سه بعدی ناهم ساخت های انتخاب شده به وسیله روش مدلسازی همسان بنیان ایجاد گردید. از شبیه سازی دینامیک مولکولی جهت بررسی رفتار دینامیک مولکولی و پایداری ناهم ساخت های انتخاب شده استفاده شد. در نهایت بر اساس نتایج بدست آمده از آنالیز دینامیک مولکولی و همچنین در نظر گرفتن فاکتورهای مهم در فرایند گلیکوزیلاسیون، ناهم ساخت های واجد شرایط شناسایی شدند. سپس توالی ژن کد کننده دو ناهم ساخت واجد شرایط (l6t و s75n) ساخته و در سلول های cho بیان شدند. افزایش وزن مولکولی در پی افزودن موتیف حفاظت شده n-گلیکوزیلاسیون در هر دو ناهم ساخت s75n و l6t مشاهده شد. بررسی میزان تجمع پروتئین ها نشان داد که هر دو ناهم ساخت هایپر گلیکوزیله تمایل کمتری به ایجاد ساختارهای تجمع یافته در مقایسه با پروتئین طبیعی دارند. به طور میانگین 1/6 ± 86/2 درصد مولکول های اینترفرون بتا طبیعی پس از القاء به وسیله گرما به یکدیگر چسبیده و ایجاد ساختارهای تجمع یافته کردند، درحالیکه در مورد پروتئین های s75n و l6t به ترتیب 1/9 ± 71/5 و 0/7 ± 64 درصد از مولکول ها ایجاد ساختارهای تجمع یافته کردند. بررسی فعالیت زیستی in vitro نیز نشان داد که هر دو ناهم ساخت، فعالیت زیستی طبیعی خود را حفظ نموده اند به طوریکه مقدار ec50 برای پروتئین طبیعی و ناهم ساخت های s75n و l6t به ترتیب برابر با7/4 ± 77/9، 6/5± 75/8 و 17/2 ± 68/4 نانوگرم در هر میلی لیتر می باشد. همچنین اثر دما بر روی بیان پروتئین ناهم ساخت s75n در مقیاس بیوراکتور نیز بررسی گردید. نتایج نشان داد که بیان پروتئین در هر سلول در کشت 32 درجه تقریبا به میزان 4 برابر کشت 37 درجه افزایش یافته است. در این پژوهش برای اولین بار ناهم ساخت های هایپر گلیکوزیله اینترفرون بتا انسانی که از یک سو تمایل کمتری به ایجاد تجمع پروتئینی داشته و از سویی دیگر فعالیت زیستی خود را حفظ کرده اند معرفی شدند که این امر ما را قادر به طراحی داروهایی با اثر گذاری بهینه می نماید.